★ FEATURED ARTICLE 摘要长期载人探月与火星任务将依赖封闭、自维持的生境微生物不可避免地与乘员、材料以及生命保障系统相互作用。常规清洁与环境控制虽可抑制微生物生长但活体种群仍可能在资源限制、环境参数波动和消毒胁迫下存续并适应。因此区分活体与死亡生物质对风险评估至关重要。然而极少有研究采用多组学与活力靶向方法考察有人居住封闭类比生境的活体微生物组。在集成式月球—火星类比生境Integrated Lunar-Mars Analog HabitatILMAH的 21 天连续居住试验中碘化丙啶单叠氮propidium monoazidePMA处理的数字 PCRPMA-dPCR显示活体细菌载量存在强烈空间异质性10⁸ 至 10¹¹ 个 16S rRNA 基因拷贝每平方米高通行模块入口、厨房、浴室、乘员舱活菌量显著高于低通行模块Welch t 检验差异 4.11 log₁₀p0.001ANOVA F₇,₃₂6.7p0.001。活体真菌载量更均匀不随位置变化p0.38。胞内 ATP 与活微生物一致并与各模块 PMA-dPCR 相关而“即用干片培养基ready-to-use dry-sheet culture media”获得的培养计数低 2–3 个数量级提示存在大量“活但不可培养viable but nonculturableVBNC”组分。从 240 株分离物中鉴定出 140 株细菌和 100 株真菌包括 42 个细菌种和 26 个真菌种其中 3 个为疑似新真菌分类单元。PMA 处理的 16S 扩增子测序显示群落结构由位置驱动PERMANOVA p0.021假单胞菌属Pseudomonas占优势低通行区偶发不动杆菌属Acinetobacter富集。鸟枪法宏基因组进一步检测到低丰度活体生物安全二级biosafety level 2BSL-2类群如肠炎沙门氏菌 Salmonella enterica、沙雷氏菌属 Serratia 物种且抗菌素耐药性基因antimicrobial resistance genesARGs与毒力因子virulence factorsVFs在高通行模块集中主要由假单胞菌属携带。该研究表明ILMAH 支撑一个由人类居住和选择存活共同维持的空间分化、胁迫耐受核心微生物组。基于活力的检测说明总 DNA 可能高估活体微生物多样性而活体群落“丰富度低但恢复力高”。该集成工作流为未来长期航天飞行及其他封闭生态系统的生物监测与微生物风险管理奠定基础。keywords集成式月球—火星类比生境活体微生物组PMA-dPCR鸟枪法宏基因组抗菌素耐药性基因毒力因子空间异质性viable but nonculturable文献信息Boles, H. O., Hernandez, E., Kahsen, J., Suzuki, T., Okochi, N., Jeon, T., Naik, S., Joshi, N., Tumeo, A., Lin, W.-J., Miliotis, G., de León, P., Green, S. J., Venkateswaran, K. (2026). Viable microbial ecology and functional potential of the Integrated Lunar-Mars Analog Habitat revealed by multi-omics analyses.Microbiome. https://doi.org/10.1186/s40168-026-02516-4期刊MicrobiomeIF14.9发表时间2026 年 9 月 28 日Article in Press在线发表研究总结ILMAH活体微生物研究背景封闭生境微生物风险总DNA高估活体需要活力靶向多组学方法PMA-dPCR定量胞内ATP检测干片培养基培养16S与鸟枪宏基因组结果高通行区活菌高假单胞菌占优势BSL-2低丰存在ARG与VF集中高通行区意义活体监测优于总DNA空间过滤强于时间演替支撑航天生物监测背景介绍随着载人航天走向长期探月与火星任务理解并缓解封闭闭环环境中的微生物风险成为关键。不同于持续受外界环境库塑造的陆地生态系统航天生境是隔离系统微生物种群主要受乘员、货物和生命保障基础设施影响。此类环境中微生物演替可能导致机会性病原占优、持久生物膜形成以及材料降解从而威胁航天员健康与航天器完整性。这一问题与制药和医疗洁净室高度相似洁净室虽受控且生物量低仍会因人员、设备和通风系统遭受微生物侵入。因此封闭航天类比生境中的微生物监测经验对生物制造、临床诊断和院感控制具有直接转化价值。本研究以 ILMAH 为对象采用 21 天连续居住场景整合培养、生化与无培养分子技术结合 PMA 活力过滤评估人类活动在资源受限密封环境中如何塑造微生物群落、活体负荷与功能潜力并为 NASA 行星保护目标提供生境内部微生物本底数据。重要结果分析方法的能力与局限培养法仅恢复在实验室条件下可生长的微生物低估总量与多样性胞内 ATP 可快速估计活体生物量但无分类分辨率并受细胞大小与代谢活性影响PMA-dPCR 降低胞外 DNA 与死细胞贡献但处理效率随样品基质、透膜性和生物量变化且只能靶向特定类群PMA-16S 扩增子可广覆盖活细菌分类但存在 PCR 偏倚与背景污染PMA-鸟枪宏基因组分类与功能更强但对低生物量样品建库更难。图 1. ILMAH 类比生境微生物监测的集成工作流。用于评估可充气式月球—火星类比生境ILMAH中微生物负荷、活力和群落组成的实验设计与分析工作流概览。从多个生境模块采集表面样品经浓缩处理后进行 ATP 检测、培养、数字 PCRdPCR、扩增子测序和鸟枪宏基因组分析包括基于 PMA 的活细胞区分。该工作流整合了定量、培养依赖和培养非依赖的方法以解析活体微生物种群及其在空间和时间上的群落结构。ILMAH 的活体微生物负荷呈现强烈空间异质性PMA-dPCR 显示人员居住的高通行模块入口、厨房、浴室、乘员舱16S 拷贝数通常 ≥10⁸ m⁻²均值 log₁₀9.12其余四模块明显更低且波动大均值 log₁₀5.02。单因素 ANOVA 支持位置对活菌负荷有强效应F₇,₃₂6.7p0.001对真菌无效应F₇,₃₂1.1p0.38。高通行与低通行模块比较显示活菌差 4.11 log₁₀p0.001真菌无差异。胞内 ATP 在高通行模块与细菌 dPCR 总体同向但在运动模块、医疗舱和 EVA 模块iATP 高出细菌 dPCR 约 1–2 个对数因真菌细胞 ATP 含量远高于细菌。培养计数普遍比 PMA-dPCR 低 2–3 个对数证实存在显著 VBNC 组分。厨房和浴室全程负荷偏高运动与植物生产模块呈“升—降—回升”轨迹。图 2. ILMAH 各模块微生物负荷的时空趋势。在 20 天居住期第 0、5、10、15 和 20 天内测量的 ILMAH 各位置微生物负荷。面板显示 ATP 相对发光单位RLU、细菌和真菌菌落形成单位CFU以及通过 dPCR 定量的细菌和真菌绝对丰度对数刻度。数据展示了总生物量、可培养种群和分子检测微生物负荷的位置特异性和时间变异性。可培养微生物多样性以假单胞菌类群为核心240 株分离物中细菌以假单胞菌门Pseudomonadotan108为主其次为放线菌门Actinomycetotan20、芽孢菌门Bacillotan9和拟杆菌门Bacteroidotan3真菌以子囊菌门n87和担子菌门n13为主。42 个细菌种与已知种 16S 相似度 98.6%26 个真菌种中 3 个疑似新分类单元ITS 相似度 97–99%。空间上高通行模块以 Pseudomonas 与 Psychrobacter 为主其他区域富集聚放线菌、芽孢菌和拟杆菌。真菌中 Penicillium caseifulvum 出现在全部八模块和现场空气对照提示持续定殖Filobasidium magnum、Vishniacozyma 与 Sarocladium killense 也在多模块存在体现胁迫耐受真菌在封闭生境中共存。图 3. ILMAH 相关细菌分离物的系统发育结构。基于从 ILMAH 表面在 21 天任务期间回收的可培养细菌分离物的近乎全长 16S rRNA 基因序列构建的最大似然系统发育树。分离物名称标明采样位置入口、厨房、浴室、乘员舱、运动模块、医疗舱、植物生产模块和 EVA 模块、采样时间第 0、5、10、15 和 20 天和菌落编号。现场对照F和阴性对照N与环境样品一起处理以监测潜在背景污染。最内彩色环表示细菌门假单胞菌门、芽孢菌门、放线菌门和拟杆菌门外层彩色符号表示采样时间点。16S 扩增子显示细菌群落由空间而非时间驱动PMA 处理样品抽平至每样 10,000 条读数得到 484 个独特扩增子序列变体ASV。Pseudomonas 在入口、厨房、浴室和乘员舱多个时间点占 80%Psychrobacter 在浴室和厨房局部富集Sphingomonas 短暂主导 EVA 模块Pantoea 在入口早期占 99.5% 后迅速衰退。基于 Bray-Curtis 的 NMDSstress0.16显示样品按位置而非时间聚类。双向 PERMANOVA 中模块位置解释 29% 方差F₇,₂₂1.64p0.021采样日解释 13% 且不显著p0.22。高通行模块活菌负荷高但丰富度低低通行模块负荷低却丰富度高说明空间区室化比任务天数更能决定细菌结构。图 4. 基于 16S rRNA 扩增子测序的 ILMAH 微生物组属水平组成与群落结构。AILMAH 各模块和采样天数的优势细菌属相对丰度低丰度类群合并至指定阈值以下。B基于 Bray-Curtis 相异性的非度量多维尺度NMDS排序显示群落按位置和时间的分离。C检验位置和采样时间效应的置换多元方差分析PERMANOVA和离散度检验PERMDISP。D位置特异性 NMDS 轨迹展示群落组成的时间变化。E叠加细菌 dPCR 绝对丰度的 NMDS 排序图。鸟枪宏基因组揭示空间、时间与植物相关序列的动态PMA 处理鸟枪测序共检出 47 个可检测类群跨细菌、放线菌、真菌和植物相关序列。高通行区细菌信号强低通行区真菌信号更突出EVA 模块第 0 天以伯克霍尔德菌科Burkholderiaceae占 92%反映入住前生物负荷残留。放线菌虽 ≤5% 读数但有明确时空趋势Mycobacteroides 在浴室、运动模块和 EVA 模块迟发富集提示适应干燥与氧化胁迫。真菌方面运动模块持续以银耳目Tremellales为主医疗舱第 5 天青霉与链格孢升高。意外的是菊属Tanacetum植物读数不在植物生产模块最高而在厨房第 10 天达 39.6%说明被动扩散而非本地生产。图 5. 基于鸟枪宏基因组测序的 ILMAH 各位置物种水平微生物动态。AILMAH 各模块和采样天数的物种水平相对丰度谱稀有类群合并至指定阈值以下。B展示物种水平群落组成时间和空间结构的 NMDS 排序图。C评估位置、采样时间和通行强度效应的 PERMANOVA 和 PERMDISP 结果。D位置特异性 NMDS 轨迹突出物种周转和持续性。E叠加细菌 dPCR 丰度的 NMDS 排序图。F叠加真菌 dPCR 丰度的 NMDS 排序图。α 多样性与测序深度在低通行区更高ANOVA 显示仅未用 PMA 样品的丰富度在模块间显著不同F₇,₃₂2.51p0.035但 Tukey 后检无显著两两差异。低通行区平均测序深度比高通行区高 8.9 倍未 PMA和 11.2 倍PMA平均丰富度高 1.66–1.79 倍。由于深度与丰富度同向变化观测到的丰富度差异部分可由测序深度解释而非纯粹生态过程。图 6. ILMAH 微生物群落的 α 多样性。AILMAH 各位置和采样天数在有或无 PMA 处理条件下的测序读段数。B香农多样性指数。C群落均匀度。D物种丰富度。比较评估了位置、时间和基于 PMA 的活力过滤的影响适用处标注了统计显著性。BSL-2 机会性病原以低丰度但活体形式存在PMA 处理宏基因组中检测到肠炎沙门氏菌、Serratia fonticola、液化沙雷氏菌S. liquefaciens、变形沙雷氏菌S. proteamaculans和红色沙雷氏菌S. rubidaea。Salmonella enterica 空间分布最广几乎见于除运动模块外所有模块厨房和入口在第 0 与第 20 天读数最高可能与食物处理和人员通行有关。沙雷氏菌属主要出现在浴室和植物生产等湿润区清洁后第 10–15 天短暂下降第 20 天再现。由于样品经 PMA 处理持续检出代表活细胞而非遗迹 DNA。整体来看BSL-2 类群以位置分层为主时间演替不强。图 7. ILMAH 内生物安全二级相关类群的分布。热图显示 ILMAH 各模块和采样天数中 BSL-2 相关细菌类群的出现和相对丰度。类群按采样位置和时间分组突出了机会性微生物的空间聚集和时间持续性。抗菌素耐药性基因与毒力因子在高通行模块集中在全部检出的 ARGs 中高通行四模块占 82%286/348全部 VFs 中占 91%2334/2553。ARGs 以多药外排泵亚基yajC、mexF、mexW、mexK和调控因子cpxR、crp为主并在整个 20 天采样中持续出现氨基糖苷类耐药基因aac(3)、aph(3’)、aph(3)在第 20 天全部八模块浮现。功能基因还涉及生物膜与胞外多糖生成、运动性、铁/氧化还原代谢、细胞包膜功能及 II/III/VI 型分泌系统T2SS、T3SS、T6SS同样在高通行模块最丰富。分类归属上Pseudomonas 是 ARGs 与 VFs 的主要载体n2483其次为 Acinetobactern60。图 8. ILMAH 活体微生物群落的功能基因谱。A抗菌素耐药性决定因子的热图包括氨基糖苷类和 β-内酰胺类相关基因。B与生物膜形成、运动性、铁/氧化还原代谢、细胞包膜生物合成和分泌系统相关的功能类别。C不动杆菌属Acinetobacter的属特异性功能谱。D假单胞菌属Pseudomonas的属特异性功能谱。热图显示了来自 PMA 处理宏基因组在各位置和采样天数的标准化命中计数。方法学参考表面擦拭采样与现场/阴性/阳性对照PBS冲洗与浓缩至约650微升ATP检测总与胞内生物量干片培养基计数可培养细菌真菌样品分两份PMA处理与未处理PMA光活化后提取DNAPan-Bacteria与Pan-Fungi dPCR绝对定量16S V4扩增子与去污染分析Illumina鸟枪宏基因组与SqueezeMeta注释Abricate比对CARD与VFDBNMDS与PERMANOVA评估空间时间效应可复用要点包括用 PMA 区分活/死细胞后再做扩增子与宏基因组以 dPCR 做绝对定量、ATP 做快速活力代理、干片培养基做低资源场景培养阴性、现场与阳性对照贯穿全流程以识别试剂与空气背景用 SqueezeMeta 做共组装与分类功能注释用 Abricate CARD/VFDB 将抗性/毒力信号回贴到分类单元NMDS 与 PERMANOVA 联合判断“空间过滤”是否强于“时间演替”。总结ILMAH 研究说明有人居住封闭生境会自发组织为低多样性、功能冗余、胁迫耐受的微生物组合。人类活动持续输入皮肤、口腔与肠道相关类群高通行模块因此活菌负荷高、优势类群如 Pseudomonas压制低丰度成员低通行模块则因竞争减弱、真菌与放线菌更长尾存在丰富度更高。时间维度上清洁会造成短暂下降与再定殖但整体群落更接近由空间微环境筛选达成的稳态而非线性演替。该研究的方法论结论是总 DNA 宏基因组会高估“活体”风险PMA 等活力过滤虽不完美却是封闭系统生物监测的必要环节。检出的 BSL-2 类群丰度很低但可存活ARGs/VFs 又集中在高接触区域因此风险管理应转向“基于活力的连续监测”而非仅看是否存在某种病原 DNA。未来加入宏转录组、宏蛋白组与代谢组可进一步区分“活且活跃”与“活但休眠”并为长期航天、潜艇、洁净室和医院隔离病房提供统一的微生物生态管理框架。参考文献Boles, H. O., Hernandez, E., Kahsen, J., Suzuki, T., Okochi, N., Jeon, T., Naik, S., Joshi, N., Tumeo, A., Lin, W.-J., Miliotis, G., de León, P., Green, S. J., Venkateswaran, K. (2026). Viable microbial ecology and functional potential of the Integrated Lunar-Mars Analog Habitat revealed by multi-omics analyses.Microbiome. https://doi.org/10.1186/s40168-026-02516-4Checinska Sielaff A. et al. Characterization of the total and viable bacterial and fungal communities associated with the International Space Station surfaces.Microbiome7, 502019. https://doi.org/10.1186/s40168-019-0666-xVaishampayan P. et al. New perspectives on viable microbial communities in low-biomass cleanroom environments.ISME J.7, 312–3242013. https://doi.org/10.1038/ismej.2012.114Salido R. A. et al. The International Space Station has a unique and extreme microbial and chemical environment driven by use patterns.Cell188, 2022–20412025. https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.01.039NCBI BioProjectPRJNA1338503ILMAH 原始宏基因组数据GitHubViable_Microbial_Ecology_ILMAH分析脚本与处理表Microbiome 期刊主页https://microbiomejournal.biomedcentral.com
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